1. 什么是生物素？

物素分子量為244.31，分子中有兩個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其中I環(huán)為咪唑酮環(huán)，是與親合素結(jié)合的主要部位；II環(huán)為噻唑環(huán)，上有一戊酸側(cè)鏈，其末端羧基是結(jié)合抗體和其他生物大分子的結(jié)構(gòu)。利用生物素的羧基加以化學(xué)修飾可制成各種活性基團(tuán)的衍生物，稱為活化生物素，同時(shí)可根據(jù)特殊的用途對(duì)這些試劑的化學(xué)性質(zhì)（溶解性、臂長(zhǎng)、可剪切與否）進(jìn)行優(yōu)化，以適合與各種生物大分子結(jié)合的需要。

                                                              生物素

2. 什么是生物素化？

生物素化是指將化學(xué)物質(zhì)或分子與生物素（biotin）結(jié)合在一起的過(guò)程。生物素是一種水溶性的維生素，也被稱為維生素B7或維生素H，它在許多生物體的生物化學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。生物素可以通過(guò)化學(xué)合成或從天然來(lái)源（如食物中）獲得。生物素化通常在生物實(shí)驗(yàn)室中用于標(biāo)記和檢測(cè)特定的分子或蛋白質(zhì)，其中生物素與待檢測(cè)的分子或蛋白質(zhì)結(jié)合，然后可以通過(guò)生物素與其他分子之間的特異性相互作用來(lái)檢測(cè)或純化目標(biāo)分子。

3. 什么是生物素-鏈霉親和素（SA-Biotin）系統(tǒng)？

                                 生物素-SP分子。分子量454.54 Da。左22.4 ?。

圖2. 標(biāo)記鏈酶親和素生物素法（LSAB）。A. 一抗體檢測(cè)靶抗原。B. 生物素化二抗可識(shí)別一抗。C. HRP偶連鏈酶親和素與生物素化的二抗體結(jié)合，與HRP偶聯(lián)的二抗相比，能夠顯著增強(qiáng)信號(hào)。

8. 如何從鏈霉親和素磁珠上解離生物素化分子?

鏈霉親和素-生物素相互作用是已知的蛋白與其他分子間非共價(jià)的生物相互作用。生物素與鏈霉親和素間的鍵形成非常迅速，一旦形成，就不會(huì)受到pH、溫度、有機(jī)溶劑和其他變性劑等多種因素的影響。從鏈霉親和素上分離生物素時(shí)，如果實(shí)驗(yàn)中使用的是生物素的衍生物或經(jīng)修飾的鏈霉親和素，那么需要特定形式和通常溫和的方法解離，除此之外通常情況下都需要非常劇烈的方法解離，并且會(huì)使鏈霉親和素變性。下面探討了其中兩種方法。

生物素化核酸：為了從Dynabeads鏈霉親和素磁珠上分離生物素化核酸，在pH 8.2的95%甲酰胺+10 mM EDTA中孵育磁珠，65°C孵育5分鐘或90°C孵育2分鐘。使用磁力架將磁珠吸到試管壁上，將含有生物素化核酸的上清液從試管中取出。有研究提到，在高溫(120C，15分鐘)下，才能在鹽溶液中解離。另外，在6 mol/L鹽酸胍溶液(pH 1.5)中也可解離；有研究指出，生物素標(biāo)記的核酸探針不能用酚抽提，否則生物素核酸會(huì)進(jìn)入酚層而損失；Holmberg等（Electrophoresis 26, 501-510, 2005）報(bào)道稱，在用離子水短時(shí)間孵育后，可將生物素化DNA從鏈霉親合素磁珠上釋放（未進(jìn)行測(cè)試）。

生物素化蛋白質(zhì)：對(duì)于生物素化蛋白質(zhì)，則可在0.1% SDS或SDS-PAGE緩沖液中煮沸磁珠3分鐘。

9. 鏈霉親和素磁珠結(jié)合片段的長(zhǎng)度和結(jié)合能力為多少?

由于具有空間位阻，因此結(jié)合能力取決于片段大小。例如，500 bp片段在Dynabeads M-280鏈霉親和素磁珠上的結(jié)合量是1,000 bp片段的2倍。長(zhǎng)DNA片段會(huì)占據(jù)磁珠周圍更多空間，使其更難“找到"磁珠上的鏈霉親和素。較短的片段更易接近鏈霉親和素。對(duì)于大于2kb的DNA片段，推薦使用Dynabeads kilobaseBINDER™試劑盒。該試劑盒包括Dynabeads M-280鏈霉親和素磁珠和一種可增強(qiáng)長(zhǎng)生物素化DNA片段（大于2kb）固定的結(jié)合液。對(duì)于大于1-2kb的DNA片段，推薦使用Dynabeads kilobaseBINDER™試劑盒，因?yàn)榻Y(jié)合液可增強(qiáng)結(jié)合能力。該結(jié)合液可使DNA線性化，進(jìn)而伸展且堿基堆疊成剛性結(jié)構(gòu)（不適用于質(zhì)?；颦h(huán)狀核酸等較短的片段）。

鹽濃度可影響生物素化核酸與Dynabeads鏈霉親和素磁珠的結(jié)合效率。對(duì)于1kb以內(nèi)的生物素化DNA片段，最佳結(jié)合條件為1M NaCl（終濃度），25℃孵育15分鐘；較長(zhǎng)的DNA片段應(yīng)固定過(guò)夜。生物素化抗體應(yīng)在含0.1% BSA，pH 7.4的PBS緩沖液中固定。由于游離生物素與Dynabeads鏈霉親和素磁珠結(jié)合的速度比大分子更快，因此應(yīng)確保樣本不含過(guò)量的游離生物素。應(yīng)使用HPLC或FPLC回收生物素化寡核苷酸，以避免樣本中游離生物素的存在。由于待固定的特定分子的大小和生物素化過(guò)程都將影響磁珠的結(jié)合能力，因此，可采用滴定法優(yōu)化每個(gè)單獨(dú)應(yīng)用中的磁珠使用量。

10. Dynabeads鏈酶親和素磁珠是無(wú)RNase的嗎?

Dynabeads鏈霉親和素磁珠不是以無(wú)RNase溶液的形式提供的。處理RNA時(shí)，應(yīng)使用DEPC處理的0.1M NaOH/0.05 M NaCl溶液清洗磁珠2次，每次1-3分鐘。DEPC毒性很強(qiáng)。但能去除RNase。清洗后，可使用DEPC處理的0.1 MNaCl溶液重懸磁珠。"DEPC處理"是指：加入0.1% DEPC，混合，室溫下解育1小時(shí)。隨后，將DEPC處理的溶液進(jìn)行高壓滅菌，以破壞DEPC。

11. 如何去除雙鏈DNA中的非生物素化鏈？

可通過(guò)堿處理或高溫處理分離DNA雙鏈。采取堿處理時(shí)，可使用0.1 M NaOH洗脫非生物素化鏈。通常情況下，該處理方法不會(huì)對(duì)磁珠產(chǎn)生任何影響。在NaOH處理前，在2X結(jié)合和洗滌緩沖液（10 mM Tris-HCl，pH 7.5，1 mM EDTA，2 M NaCl）中清洗Dynabeads/DNA復(fù)合物1次，除去上清液。高鹽濃度將有助于減少電荷，從而使非特異性結(jié)合最小化。向Dynabeads/DNA復(fù)合物中加入新鮮配制（很重要）的0.1 M NaOH溶液，室溫下旋轉(zhuǎn)孵育2-3分鐘（最多5分鐘）。除去含有非生物素化鏈的上清液。再用0.1 M NaOH溶液清洗Dynabeads/DNA復(fù)合物1次，除去上清液。第一次洗脫時(shí)，即可洗脫下大部分DNA。除了堿處理，也可進(jìn)行加熱處理，在水中95°C加熱5分鐘即可。為防止再退火，堿處理或高溫處理后必須快速?gòu)拇胖樯戏蛛xDNA，最好在冰上操作。加熱會(huì)在一定程度（在水中約為7%）上引起生物素化DNA從鏈霉親和素上解離。因此，通常更推薦采用堿處理法。

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