-
提高實驗和質量的實用技巧
發(fā)布時間： 2024-03-20 點擊次數(shù)： 905次1.提高實驗的效率
1）實驗前有計劃安排、預備方案或者“車輪戰(zhàn)"（細胞實驗）
一般從基礎的培養(yǎng)細胞開始，開始實驗時，實驗方法一般來自于實驗室或者文獻中條件優(yōu)化以及自我推測及驗證，因此做實驗之前預想實驗方案有助于我們不至于“手忙腳亂"。
以實驗前的細胞鋪板實驗為例：
表1 常用細胞培養(yǎng)體系：
細胞鋪板的孔數(shù)一般取決于我們后期實驗的目的，實驗前了解各類細胞的鋪板數(shù)量以及培養(yǎng)基添加量都十分重要。以病毒或者細菌感染細胞模型來說，我們需要一個比較準確數(shù)量級的細胞數(shù)目和病毒或菌液濃度得后期實驗的MOI值，細胞計數(shù)和病毒及菌液濃度測定也很關鍵；
細胞鋪板：我們需要收集盡可能多的細胞，原因是當我們剩余出來的細胞可用于細胞傳代繼續(xù)保留，可若是鋪板數(shù)目達不到（重新離心收集細胞浪費時間）可能會導致加藥濃度過大使得細胞大量死亡而影響后期實驗，比如你要提取RNA或者蛋白，細胞數(shù)目不足，后期的RNA濃度或者BCA測蛋白濃度的結果都不是非常理想繼而影響后面實驗的進展。
2）具體安排（Western blot實驗）
從試驗干擾開始（給藥處理），根據(jù)實驗步驟來講，完整的Western blot實驗預計2-3天。
（1）以給藥時間24h為例：24h后，收集細胞提取蛋白，貼壁細胞加IP裂解液或RIPA裂解液用細胞刮板移至1.5ml離心管；懸浮細胞收集細胞至離心管離心去除培養(yǎng)基，用PBS清洗離心去除上清再加入裂解液，預計提取蛋白以及BCA測蛋白濃度一上午的時間，估計上樣體積加入loading buffer煮蛋白置于-80℃保存；下午跑蛋白電泳，SDS-PAGE膠可于前一天晚上制好防止-4℃冰箱保存（用少量純水用封裝袋保存）或使用預制膠，大概1多小時蛋白maker跑到距離膠最下面1-2cm處停止電泳；轉模，根據(jù)目的蛋白的大小確定轉膜時間和毫安數(shù)，結束后裁膜用5%脫脂奶粉封閉，之后孵育一抗4℃過夜，第二天洗膜孵育二抗并進行顯影，因此步驟時間熟練的話2天就可以完成一次WB實驗。
（2）預備方案：實驗重復是不可避免的，因此預備下一周期實驗方案（車輪戰(zhàn)）有助于縮短時間提高效率，當然，師兄師姐以及廣大學術里的經驗小tips也有助于提高實驗效率。例如，在WB配制SDS-PAGE膠的凝固時間通常會隨季節(jié)溫度的變化而改變，夏季和冬季應該時間就會產生差異（冬季凝固較慢），再者，AP 和TEMED 作為促凝劑，一般都是最后加入，尤其是AP（過硫酸銨）。實驗之前我們可能都會設計一個預期結果，我們可以在上一周期實驗的空余時間預備下一周所需要的實驗條件，例如重新細胞鋪板給藥等待時間周期等等。
2.提高實驗結果的質量：減小系統(tǒng)誤差，消除人為錯誤
①減小系統(tǒng)誤差：一般設計3個重復孔，但是后期我統(tǒng)計數(shù)據(jù)時發(fā)現(xiàn)，誤差bar仍可能較長，這時我們可以設計4個復孔，去除一個誤差最大的值也有助于結果的準確性。這時就要求我們會更加精準的使用移液槍。另外，重復實驗也有助于提高我們加樣的準確性。
②制備預混液：例如我要做30(2×5×3)孔兩個基因（包含內參），5個處理，3個復孔，那么我的熒光染料一個孔需要5ul，正反引物2ul，那么我們可以再不浪費試劑的情況下，計算量可為:15.5×5+15.5×2或者（15×5+15×2）×1.1，這一定程度上都是為了消除我們人為加樣誤差。
③另外我們盡量增大加樣體積減少誤差：針對于10ul體系，提前將正反引物混合，配制SYBY+正反引物和cDNA+ddH2O，這時的體積為6+4或者7+3可減少加樣體積小帶來的加樣誤差。
④相關試劑使用前需離心使用：另外，在八聯(lián)管上機前需要用干凈的手套蓋上透明蓋子，適當離心將反應體系離心至管底。
以上就是本期的內容，更多資訊，歡迎點擊安培生物網站鏈接了解更多技術與產品資訊。
安培生物致力成為推動生命科學進步值得信賴的合作者
深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術實力、先進的經營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業(yè)?？偛吭O在廣東，服務面向全國。安培生物集進口試劑、實驗室耗材銷售、技術服務與合約開發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司，旨在為生命科學的發(fā)展提供較好的產品與服務。本公司建立了涵蓋分子生物學、細胞生物學、免疫學、信號傳導和神經科學等領域的產品供應線，在各個領域內向用戶提供較高的水平和質量穩(wěn)定的產品，安培生物致力于為廣大的科研機構、高等院校等客戶提供各種產品、技術支持與服務。
可以在第一時間為用戶提供比較先進的專業(yè)資訊和完備的產品和物流服務。 專業(yè)的技術力量使得我們能夠為廣大用戶提供強大的技術支持，深厚的人脈資源使得我們在全國主要城市擁有眾多的合作伙伴，安培生物非常榮幸能將世界上先進的高科技產品推薦給國內從事生物學領域科研的老師和同仁。作為專業(yè)性的產品供應商，公司出資存?zhèn)淞舜罅楷F(xiàn)貨，配合優(yōu)秀的銷售隊伍以及專業(yè)的技術支持，隨時為客戶提供服務。
銷售熱線
產品中心
Products
技術支持：化工儀器網 地址：深圳市寶安區(qū)新安街道寶民社區(qū)創(chuàng)業(yè)二路5號建設銀行樓創(chuàng)業(yè)二路5-1 管理登陸 sitemap.xml
微信二維碼
