原理：

人類多能干細(xì)胞(HPSCs)具有自我更新能力，但在體外對環(huán)境擾動高度敏感，這對其治療應(yīng)用構(gòu)成了挑戰(zhàn)。迫切需要進(jìn)一步的突破，以確保這些細(xì)胞安全和穩(wěn)健的長期生長和功能分化。在這里，通過高通量篩選策略來確定一種小分子混合物，它可以提高h(yuǎn)PSCs及其分化后代的生存能力。Chroman 1、Emricasan、Polyamines和trans-ISRIB(CEPT)的組合通過同時(shí)阻斷幾種原本損害細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的應(yīng)激機(jī)制，提高了遺傳穩(wěn)定的hPSCs的細(xì)胞存活率。CEPT為干細(xì)胞研究中的幾個(gè)關(guān)鍵應(yīng)用提供了有力的改進(jìn)，包括常規(guī)細(xì)胞傳代、多能干細(xì)胞和分化細(xì)胞的冷凍保存、類胚體(EB)和類器官形成、單細(xì)胞克隆和基因組編輯。因此，CEPT代表了一種綜合細(xì)胞保護(hù)的多藥理學(xué)策略，為高效和安全地利用hPSCs提供了理論基礎(chǔ)。

材料與儀器：

人類多能干細(xì)胞(HPSCs),二甲基亞砜、Y-27632、Chroman 1或CEPT，超低吸附（ULA）板

步驟：

1.分離hESCs

2.在二甲基亞砜、Y-27632、Chroman 1或CEPT存在下將其接種到超低吸附（ULA）板中。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

分離hESCs，并在二甲基亞砜、Y-27632、Chroman 1或CEPT存在下將其接種到超低吸附(ULA)板中。24小時(shí)后，觀察到顯著的差異，因?yàn)?/span>CEPT不僅產(chǎn)生了最多數(shù)量的EBS，而且這些培養(yǎng)物幾乎沒有細(xì)胞碎片(圖a)。細(xì)胞存活率的顯著改善在更可控的條件下得到進(jìn)一步證實(shí)，即在執(zhí)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后在單個(gè)井中產(chǎn)生單個(gè)EBS。與Y-27632(圖e)相比，暴露于CEPT 24小時(shí)產(chǎn)生了更大的EBs(圖b，c)，最大限度地減少了細(xì)胞死亡(圖d)，并提高了細(xì)胞存活率242%。在用CEPT啟動的EBs中觀察到了超過7天的強(qiáng)勁和持續(xù)的細(xì)胞生長，但用Y-27632(圖e)沒有觀察到。因此，在這些條件下，CEPT處理更可靠地產(chǎn)生能夠多譜系分化的EBs(圖f)。

第30天HE染色的組織學(xué)分析顯示神經(jīng)組織分化有顯著差異(圖g)。前腦標(biāo)記FOXG1的免疫組織化學(xué)證實(shí)，使用CEPT產(chǎn)生的有機(jī)化合物產(chǎn)生了更多的神經(jīng)組織，顯示出復(fù)雜的形態(tài)(圖h)。與Y-27632相比，CEPT產(chǎn)生的有機(jī)體神經(jīng)分化的改善也被使用大量可獲得的核糖核酸測序(rna-seq)數(shù)據(jù)進(jìn)行的無偏見轉(zhuǎn)錄分析所證實(shí)。對熱門類別的比較表明，CEPT產(chǎn)生的有機(jī)物具有更好的神經(jīng)分化，而Y-27632處理導(dǎo)致神經(jīng)和非神經(jīng)類別，如腎臟、血液和樹突狀細(xì)胞(圖i)。當(dāng)Y-27632再次被CEPT取代時(shí)，觀察到改善了腎臟類器官的形成。

與Y-27632(圖a-c)相比，解凍后的冷凍保存的hESCs(WA09)在CEPT處理24小時(shí)后存活率顯著改善(約300%)。為了進(jìn)行更系統(tǒng)的比較，使用了不同的試劑組合來進(jìn)行細(xì)胞的冷凍保存和解凍(圖d-g)。有趣的是，使用三種不同的冷凍保存方法(Y-27632、CEPT和商業(yè)上可用的mFreSR)影響很小，結(jié)果相似，而在解凍期間使用的試劑產(chǎn)生了很大的差異(圖d)。因此，在CEPT、Y-27632、Revitacell、Clone或SMC4存在下，所有五個(gè)hPSC株系在CEPT存在下顯示出比DMSO、Y-27632、Revitacell、Clone或SMC4更高的存活率(圖e-g)。此外，由于生物樣本庫對再生醫(yī)學(xué)至關(guān)重要，也證實(shí)CEPT治療在長期儲存(用CEPT冷凍保存12個(gè)月)以及hESCs、IPSCs和星形膠質(zhì)細(xì)胞解凍后提供了更高的細(xì)胞存活率。同樣，當(dāng)長期冷凍保存的細(xì)胞在解凍前在干冰上保存72小時(shí)以模擬干細(xì)胞產(chǎn)品的運(yùn)輸時(shí)，CEPT的使用再次顯著提高了細(xì)胞存活率。

接下來，研究了CEPT是否也可以改善冷凍保存的分化細(xì)胞的解凍。從一家商業(yè)供應(yīng)商(Fujifilm CDI)獲得的幾種IPSC來源的細(xì)胞類型，包括心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、運(yùn)動神經(jīng)元和內(nèi)部生成的星形膠質(zhì)細(xì)胞，在CEPT治療后顯著提高了細(xì)胞存活率(圖h)。例如，心肌細(xì)胞的結(jié)果表明與DMSO相比，存活率提高約36%，運(yùn)動神經(jīng)元的改善約63%。心肌細(xì)胞和運(yùn)動神經(jīng)元存活率的提高具有長期的效果，在電鍍后多電極陣列測量中，有長達(dá)14天的功能活動增強(qiáng)(圖i-k)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論：

CEPT不僅可以減少干細(xì)胞在形成EB過程中的凋亡，而且可以促進(jìn)EB和微器官的生長和分化。同時(shí)，CEPT也可以極大的減少干細(xì)胞以及干細(xì)胞產(chǎn)品在凍存復(fù)蘇過程中的凋亡。因此，CEPT在人源干細(xì)胞的基礎(chǔ)研究和臨床運(yùn)用中都有廣闊的運(yùn)用前景。

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