1. 前言

與其他真核細(xì)胞一樣，植物細(xì)胞中，糖基化通常發(fā)生在分泌蛋白質(zhì)上，雖然在細(xì)胞質(zhì)蛋白和核蛋白上也發(fā)現(xiàn)一些糖基化反應(yīng)。根據(jù)寡糖部分和蛋白質(zhì)骨架之間的連接方式，可將糖基化分為兩種類型：N -糖基化和 O-糖基化。植物中 N-糖基化研究最多。

1.1 N-糖基化

與其他真核細(xì)胞一樣，在植物細(xì)胞中，N-糖基化只發(fā)生在進(jìn)入分泌途徑的蛋白質(zhì)上。它從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的寡聚糖前體 Glc3Man9GlcNAC2 共翻譯轉(zhuǎn)移到構(gòu)成初生蛋白質(zhì) ( Asn-X-Ser/Thr，X 可以是除脯氨酸和天冬氨酸以外的任意一種氨基酸）N--糖基化序列的特異天冬酰胺殘基上開(kāi)始，當(dāng)新合成的蛋白質(zhì)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔后就發(fā)生 N 端序列糖基化反應(yīng)。接著，當(dāng)糖蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)經(jīng)高爾基體到達(dá)其最終目的地時(shí)，Glc3Man9GlcNAC2 前體沿著分泌途徑進(jìn)行進(jìn)一步加工處理。如果糖基側(cè)鏈能被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中的糖苷酶和糖基轉(zhuǎn)移酶加工的話，Glc3Man9GlcNAc2 前體就會(huì)被成功轉(zhuǎn)化為 Man9GlcNAc2 和 Man5GlcNAC2 范圍內(nèi)的髙甘露糖型 N-聚糖， 以及復(fù)雜形式的 N-聚糖。植物復(fù)雜形式 N-糖苷有一個(gè)掛在中心的近端氨基葡糖上的 α-1-3 巖藻糖；一個(gè)與中心少甘露糖連接的 β-1-2 木糖殘基，和/或與它們的末端天線（稱為 Lewisa ) 連接的 Gal/β-3  (Fucα-1-4 ) GlcNAc 寡聚糖末端序列，稱為 Lewisa[1] 。



1. 2 O-糖基化

在植物細(xì)胞中 O-糖基化可分為兩種類型。即分泌蛋白糖基化或細(xì)胞質(zhì)/核蛋白糖基化。蛋白質(zhì)上不同位點(diǎn)的 O-連聚糖的性質(zhì)不同。

1. 分泌蛋白質(zhì)的 O-糖基化

對(duì)植物分泌蛋白的 O-糖基化的了解還很少。只有少數(shù)幾篇文章報(bào)道了與植物糖蛋白上的一些絲氨酸或蘇氨酸殘基連接的 O-聚糖。一些糖蛋白，如細(xì)胞壁伸展蛋白和液泡中的甘薯貯藏蛋白（sporamin) 都被認(rèn)為是一類含有一個(gè)單半乳糖 O-糖基化的絲氨酸殘基的糖蛋白 [ 2，3] 。分析鑒定水稻被轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡的谷蛋白也是為了證明哺乳動(dòng)物黏蛋白型糖基化的存在，植物中這一類型 O-糖基化依然存在爭(zhēng)議 [4] 。第二種類型的分泌蛋白 O-糖基化要求糖蛋白脯氨酸殘基的羥基化，我們已發(fā)現(xiàn)植物中的富含羥脯氨酸的糖蛋白（HRGP)。HRGP 是植物中主要表面糖蛋白。這些定位于細(xì)胞壁或細(xì)胞質(zhì)膜外表面的 HRGP，有三類蛋白質(zhì)：伸展蛋白，阿拉伯半乳糖鏈蛋白（AGP ) 和茄科凝集素 。伸展蛋白和茄科凝集素含有由絲氨酸- ( 羥脯氨酸 )4 組成的重復(fù)序列，這里 的絲氨酸可被 O-糖基化，而羥脯氨酸可被阿拉伯糖鏈取代 [5] 。這個(gè)阿拉伯糖化過(guò)程在髙爾基體中發(fā)生 [6]。AGP 家族是那些高糖基化的胞外蛋白和細(xì)胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)。其蛋白質(zhì)部分富含羥脯氨酸（Hyp) 、絲氨酸、丙氨酸、蘇氨酸和甘氨酸，并含有 Ala-Hyp 重復(fù)序列。脯氨酰-4-羥化酶的催化作用可將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和/或高爾基體中脯氨酸轉(zhuǎn)換成羥脯氨酸 [ 4，7 ] 。AGP 的 O-糖基化過(guò)程是一種添加了被  β-1-6 半乳糖支鏈取代 β-1-3 半乳糖數(shù)組的半寡聚糖支鏈的羥脯氨酸后的循序漸進(jìn)的方式，β-1-6 半乳糖支鏈反過(guò)來(lái)由阿拉伯糖或者其他的低豐度的單糖依次形成分支。

2. O-GlcNAc 糖基化修飾

另外一種在哺乳動(dòng)物中得到詳細(xì)闡述的 O-糖基化形式是細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白的 O-GlcNAc 糖基化。這種在蛋白質(zhì)上添加 O-GlcNAc 的修飾，在真核生物中非常普遍，發(fā)生在絲氨酸或蘇氨酸的 β-連接上。盡管序列 Tyr-Ser-Pro-Tb- Ser- Pro -Sef ( 標(biāo)有 * 是發(fā)生糖基化的氨基酸）代表一類典型的 GlcNAc 連接位點(diǎn) [9] ，但是對(duì)可被  OGlcNAc 糖基化的保守序列還不十分清楚。OGlcNAc 糖基化是一種高度動(dòng)態(tài)過(guò)程，而且通常與 O-磷酸化修飾交互進(jìn)行 [10] 。糖基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下，糖基被添加到蛋白質(zhì)上，而在 OGlcNAc 糖苷酶的催化作用下，糖基被從蛋白質(zhì)上移除許多細(xì)胞活動(dòng)過(guò)程，如蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞骨架附著在細(xì)胞膜上或蛋白合成等都參與了這個(gè)糖基化修飾，目前對(duì)它的確切作用還了解不多。

植物中有關(guān) OGlcNAc 糖基化的報(bào)道還很少，與 OGlcNAc 轉(zhuǎn)移酶相似的兩個(gè)被命名為 SPINDLY 和 SEC 的酶已在擬南芥中克隆出來(lái) [ 11，13] 。它們?cè)陔x體條件下具有 OGlcNAc 轉(zhuǎn)移酶活性，但還不清楚它們?cè)谥参矬w內(nèi)的天然底物。此外，有報(bào)道將一些細(xì)胞核蛋白描述為攜帶末端為 GlcNAc 的 O-連聚糖的糖蛋白 [14，15 ] 。這些細(xì)胞核蛋白是否為 SPIN-DLY 和 SEC 的底物仍是個(gè)謎。

1.3 糖基化的異質(zhì)性

真核細(xì)胞的成熟分泌糖蛋白 N-糖基化模式是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的寡聚糖共翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程和其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體內(nèi)加工的共同結(jié)果。多肽折疊因子會(huì)影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)潛在糖基化位點(diǎn) [16] 。結(jié)果導(dǎo)致蛋白質(zhì)中的多個(gè) N-糖基化位點(diǎn)中有些位點(diǎn)為無(wú)效糖基化位點(diǎn)，其他一些則未能全部糖基化 [17~19] 。

同時(shí)，多糖側(cè)鏈的修飾加工與其是否接觸到成熟的酶相關(guān)。雖然被包被在蛋白分子結(jié)構(gòu)內(nèi)部的寡糖仍然是未修飾的高甘露糖型 N-糖鏈，但位于蛋白質(zhì)表面的糖苷將成熟轉(zhuǎn)變?yōu)閺?fù)雜形式的 N-糖苷 [17] 。這種現(xiàn)象也同樣發(fā)生在 O-糖苷上。因此，要鑒定植物糖蛋白的糖基化，不僅需要鑒定糖-蛋白連接及附著在糖蛋白上的寡聚糖的結(jié)構(gòu)，而且還要確定其在蛋白分子骨架上的潛在糖基化位點(diǎn)的分布/定位。

本章的目的是向植物蛋白質(zhì)組學(xué)工作者介紹一些工具和方法，用于確定所鑒定的蛋白是否為糖蛋白，類別以及蛋白骨架上糖苷側(cè)鏈的位置。本章的最后部分將論述植物糖蛋白質(zhì)組學(xué)中的糖蛋白鑒定方法。

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