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    哺乳動(dòng)物細(xì)胞瞬時(shí)基因轉(zhuǎn)移法制備重組蛋白實(shí)驗(yàn)

    發(fā)布時(shí)間: 2022-03-14  點(diǎn)擊次數(shù): 1387次

    材料與儀器


    步驟


    一、轉(zhuǎn)染方法

    對(duì)于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 (Upofection), 可以從商業(yè)途徑獲得許多配方,這些配方都具有單一的專(禾刂)化組分,而且毫無疑問,它們中的大部分都能非常有效地將質(zhì)粒 D N A 轉(zhuǎn) 人 細(xì) 胞 。其缺點(diǎn)是價(jià)格不菲—- 在使用這些試劑時(shí),對(duì)于超出數(shù)百毫升規(guī)模的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,經(jīng)濟(jì)上是不可行的。大規(guī)模的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法要求轉(zhuǎn)染試劑能很容易大量獲取, 批次間的變化小以保證轉(zhuǎn)染的一致性。盡管也存在一些其他的選擇,如將殼聚糖 (chitosan) 及其衍生物和14D E A 2 作為轉(zhuǎn)染試劑(D a n g and L e o n g , 2006; Jiang and Sharfstein, 2008; K u s u m o t oet a L , 2 〇〇 6),但磷酸鈣(calcium phosphate) 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染以及基于聚乙烯亞胺 (polyethylenimine,PEI) 的質(zhì)粒絡(luò)合 (plasmidcomplexation) 和細(xì)胞攝人是僅有的滿足這些要求的兩種常用技術(shù)。

    1.利 用 聚 乙 烯 亞 胺 在 W a v e ™ 生物反應(yīng) 器 中 進(jìn) 行 大 規(guī) 模 瞬 時(shí) 轉(zhuǎn) 染

    近些年 ,一 次 性的 W a v e ™ 生物反應(yīng)器得到了普遍的認(rèn)可,因?yàn)橄鄬?duì)于經(jīng)典的攪拌釜反應(yīng)器,其保養(yǎng)和操作更加容易。雖 然 100 L 工作體積的反應(yīng)器也實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化,擁有300 L 工作體積的樣機(jī)也在開發(fā)之中, 但最為常用的反應(yīng)器的工作體積是 10 L 和 20 L 。是否 使用 W a v e ™ 生物反應(yīng)器進(jìn)行 10 L 以下的轉(zhuǎn)染取決于經(jīng)濟(jì)可行性—我們更傾向于使
    用搖瓶進(jìn)行小規(guī)模的生產(chǎn) ( F e m b a c h flasks, Corning)。據(jù)報(bào)道,也有其他的反應(yīng)器或振搖設(shè)備成功的用于瞬轉(zhuǎn)培養(yǎng)(Muller et al. , 2005; P h a m et aL , 2006; Stettler et al.,2007)。

    下面介紹以 H E K 293 T 細(xì)胞為宿主,使 用 M 11V 3 無血清培養(yǎng)基 (Novartis proprietary) 進(jìn)行 10 L 規(guī)模的抗體生產(chǎn)的方法。 抗體的兩條鏈都克隆至同一個(gè)表達(dá)載體。

    (1) 將一個(gè) 20 L 的 W a v e ™ 袋(Sartorius Stedim Biotech, G 6ttingen, G e r m a n y ) 安裝 到 W a v e ™ 工 作 平 臺(tái)(W a v e - Bioreactor S P S 5O ) ,并連接到一個(gè) D A S G I P 氣體混合模塊上(D A S G I P , Juelich, G e r m a n y )。然后,在 袋 中 接 種 4 L H E K 293T 細(xì)胞培養(yǎng)物,細(xì)胞密度約 為 I.8 X IO6 個(gè)細(xì)胞/m L 。

    (2) 我 們 采 用 了 下 列 過 程 參 數(shù) 和 條 件 : 氣 體 流 速 2 〇 L /h ; 混 合 氣 體 包 括 2 1 % ?2 5 % 〇 2、0 % C O 2; 溫度 37°C ; p H 6. 8?7, 4; 搖擺速率 10 r Z m i n; 搖擺角度 7°

    (3) 將 10 m g 質(zhì) 粒 D N A (1 m g /m L ) 與 M 11V 3 培養(yǎng)基混合至終體積為 500 m L , 室溫孵育 10 m i n 。然 后 ,用 0. 22 p m 的 G P E X P R E S S P L U S 濾 膜(Millipore, Billerica,
    M A ) 將稀釋后的 D N A 溶液過濾除菌。

    ⑷ 將 3 〇 m L P E I 溶 液(I m g /m L ) 與 500 m L M l l V 3 培 養(yǎng) 基 混 合 ,室溫孵育10 m i n 。然后 用 0.22um 的 G P E X P R E S S P L U S 濾膜將稀釋后的 P E I 溶液過濾除菌。

    注意:P E I 儲(chǔ)存液在使用前是應(yīng)當(dāng)無菌的,經(jīng)過過濾的,分 裝 并 凍 存 于 一 80°C 直至使用。

    (5) 接下來,將 P E I 溶液加至 D N A 溶液中,室溫孵育 15 m i n 以形成多聚絡(luò)合物。

    (6) 無菌條件下,將 D N A -P E I -M 11V 3 混合物加至 W a v e ™ 袋中的細(xì)胞培養(yǎng)物中, 終體 積 為 5 L 。繼續(xù)用下列參數(shù)孵育 5?6 h : 氣體流速 M L /h ; 混合氣體包括 2 5 % O 2、〇 %CO2; 溫度 37°〇 ; 口 1^6.8?7.4; 搖擺速率 1 〇 r/min; 搖擺角度 7°。

    (7) 然后,向 5 L M 11V 3 培養(yǎng)基中補(bǔ)加 100 m L R X l 組合補(bǔ)料 (補(bǔ)料含有氨基酸、葡萄 糖 和 谷 氨 酰 胺 ;由 Irvine Scientific, Santa A n a , C A 定 做),無 菌 條 件 下 將 其 加 至W a v e ™ 袋的細(xì)胞中。在生產(chǎn)期,采 用 如 下 參 數(shù) : 氣 體 流 速 30?40 L /h ; 混合氣體包括3 〇 %?4 〇 % O 2、0 % C O 2; 溫 度 37°C ; p H 6. 8?7.4(用 p H 9.2 的碳酸氫鹽溶液調(diào)整,Sigm a Aldrich, B u c h s , Switzerland); 氣體飽和度 6 0 % ?100%; 搖擺速 率 14?18 r/mi. n ; 搖擺角度 7°。

    (8) 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在 W a v e ™ 生物反應(yīng)器中培養(yǎng) 10 天 ,以生產(chǎn)抗體。
    注 意 : 為了生產(chǎn)重組蛋白,生 產(chǎn) 期 通 常 為 5?7 天 ,但如果目標(biāo)蛋白質(zhì)對(duì)蛋白酶解敏感 ,這個(gè)時(shí)間可以縮短。抗體分子的生產(chǎn)時(shí)間可延長(zhǎng)至 1 0 天 。

    (9) 每天取樣,用 V 1 -Cell 細(xì) 胞 計(jì) 數(shù) 設(shè) 備(B e c k m a n Coulter) 測(cè)定細(xì)胞密度和成活率 。用 Bioprofile 400 分析儀 (Labor-Systeme Fliickiger, Switzerland) 測(cè)定營養(yǎng)狀態(tài)、p H
    及氣體飽和度。用 蛋白 A 高壓液相測(cè)定 I g G 濃度(圖 15. 1)。

    (10) 10 天后,在無菌條件下收集細(xì)胞,橫流過濾(cross-flow filtration) (FreseniusFilter P l a s m a F l u x, 0.2 fim) 以 除 去 細(xì) 胞 。然 后 將 無 細(xì) 胞 的 上 清 液 用 中 空 纖 維 過 濾(hollow fiber filtration)(H e m o f l o w F 10 H P S , Fresenius, Stans, Switzerland, 10 k D acutoff) 的方法濃縮 10 倍 。

    (11) 用 Protein A 親和色譜和分子篩色譜對(duì)濃縮液進(jìn)行純化。對(duì)上述這些標(biāo)準(zhǔn)方法有多種改進(jìn), 這些改進(jìn)后的方法已經(jīng)經(jīng)過測(cè)試并發(fā)表,其中的一些在下面簡(jiǎn)短列出。

    ① 在 利用 C H O 細(xì)胞系進(jìn)行生產(chǎn)的過程中,通過轉(zhuǎn)換溫度至 30?32°C 提高表達(dá)速率(Backliwal et al. , 2008a ; Galbraith et al. , 2006)。

    ② 用微管解聚劑諾考達(dá)唑(nocodazole) 處 理 細(xì) 胞 使 其 細(xì) 胞 周 期 停 滯 在 G 2/M 期(Tait et a L , 2004)。

    ③ 用抑制劑,如丁酸鈉(sodium butyrate)、丙 戊 酸(valproic acid) 處 理 去 抑 制 C H O和 H E K 293 細(xì)胞的組蛋白脫乙?;福╤istone deacetylase) 及 D N A 甲基轉(zhuǎn)移酶(D N Amethyl transferase) (Backliwal et al. , 2008c)。

    ④ 對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行遺傳改造,以阻止凋亡 (apoptosis) 或克服未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答 (unfolded protein response,U P R ) 造成的抑制作用(Backliwal et al. , 2008c; Majors et al. ,2007; Tigges and Fussenegger, 2006) ?

    結(jié)論

    正如該領(lǐng)域中已經(jīng)發(fā)表的大量數(shù)據(jù)所反映的那樣, 過去幾年,就技術(shù)發(fā)展和產(chǎn)量而言 ,通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)制備重組蛋白已經(jīng)達(dá)到了一個(gè)令人印象深刻的狀態(tài)。不過,盡管有報(bào)道指出,利用大規(guī)模瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)在生物反應(yīng)器中生產(chǎn)蛋白質(zhì),已能獲得相當(dāng)高的抗體滴度—大 于 I g / W B a c k l i w a l et al. , 2008a),但現(xiàn)在就想用它替換過程繁瑣的構(gòu)建細(xì)胞系方法用于生物治療藥物的生產(chǎn)還為時(shí)尚早。我們通過對(duì) 1 〇〇多個(gè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)實(shí)驗(yàn)的觀察表明,對(duì)于不同的基因,表達(dá)量變動(dòng)很大: 一般蛋白質(zhì)的表達(dá)量從 I m g / L 到超過170 m g /L ; 抗體的平均表達(dá)量為 20?40 m g /L ,但常常分布在兩個(gè)(木及)端。毫無疑問, 在表達(dá)載體設(shè)計(jì)、培養(yǎng)條件優(yōu)化和可能的細(xì)胞系改造方面, 我們還需要進(jìn)一步的技術(shù)改進(jìn), 但這種方法總體上令人印象深刻的成功證明了這種努力是值得的。



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